體內(nèi)組織細胞在體外培養(yǎng)時，所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似，但由于物種、個體遺傳背景及所處發(fā)育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養(yǎng)技術措施亦不盡相同，現(xiàn)介紹個別組織細胞培養(yǎng)的要點如下:
第一節(jié) 上皮細胞培養(yǎng)
上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細胞培養(yǎng)中常混雜有成纖維細胞，培養(yǎng)時生長速度往往超過上皮細胞，并難以純化，同時上皮細胞難以在體外長期生存，因此純化和延長生存時間是培養(yǎng)關鍵。
體內(nèi)上皮細胞生長在膠原構成的基膜，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長，另外人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)在以3T3細胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）時，細胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH、Ca2+含量和溫度，向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子，均有利于表皮細胞生長。
以表皮細胞為例，用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）
1、取材：外科植皮或手術殘余皮膚小塊，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5－1平方厘米小塊。
2、置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。
3、換入0.25%胰蛋白酶中，4℃過夜。
4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。
5、取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分鐘。
6、反復吹打，制成懸液。
7、培養(yǎng)：用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸去上清。
8、直接加入培養(yǎng)基（Eagle加20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶，CO2溫箱培養(yǎng)。
第二節(jié) 內(nèi)皮細胞培養(yǎng)
內(nèi)皮細胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細胞，對于研究內(nèi)皮細胞再生、腫瘤促血管生長因子（TAF）等有很大價值。
研究人內(nèi)皮細胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡便，其法如下：
1、產(chǎn)后新鮮臍帶，無菌剪取10—15厘米長一段，如不能立即培養(yǎng)，可于12小時內(nèi)保存于4℃。
2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊，以防液體返流。
3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶，充滿血管，消化3—10分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。
4、吸出含有內(nèi)皮細胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復）。
5、離心去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見細胞長成單層。
第三節(jié) 神經(jīng)細胞培養(yǎng)
神經(jīng)細胞（神經(jīng)元）不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細胞因子時，可出現(xiàn)一定程度的分化，長出突起等現(xiàn)象，但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。
人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長的膠質(zhì)細胞，也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來，膠質(zhì)細胞在培養(yǎng)中生長不穩(wěn)定，不易自發(fā)轉化，但對外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉化。
一． 設備： 無菌操作設備。
二． 大型設備CO2培養(yǎng)箱：恒溫5%、10%CO2維持培養(yǎng)液中pH值。
倒置顯微鏡：用于每天觀察貼壁細胞生長情況。
解剖顯微鏡，用于準確地取材。
常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養(yǎng)液，解剖液和鼠尾膠。
低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲存血清酶，貴重物品和試劑。
電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。
高壓消毒鍋：用于消毒培養(yǎng)皿，手術器械。
過濾器：配制解剖液、培養(yǎng)液，必須過濾后才可使用，以去除細菌。
滲透壓儀，pH劑，天平等。
三． 培養(yǎng)器皿及手術器械
1 培養(yǎng)皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直徑。
2 培養(yǎng)板，24-40孔，可用于開放培養(yǎng)。
3 培養(yǎng)瓶：
4 吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。
5 各類培養(yǎng)液貯存器。
6 小型手術器械。
準備：
一 配制培養(yǎng)液
（1） 解剖液：以無機鹽（去除Ca2+, Mg2+）加葡萄糖配制成PBS緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值。
（2） 基礎培養(yǎng)基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。
（3） 接種培養(yǎng)液：用于胰酶消化后的細胞分散，做成細胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%馬血清，當天配制。
（4） 維持培養(yǎng)液：接種后24h，全部換成此液，后每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營養(yǎng)物質(zhì)。
二 培養(yǎng)基質(zhì) 常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴氨酸，再涂膠
三 消毒培養(yǎng)皿的備用。所有培養(yǎng)器皿均需清水沖洗2-3d，達兩次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包裝，置于烤箱中干燥消毒，于培養(yǎng)前1天進行。
神經(jīng)細胞分散培養(yǎng)
（一） 選材 常用胚胎動物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過也有認為與組織相關。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚，則黑質(zhì)以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細胞成活率高，顆粒細胞正在分化；脊髓與DRG聯(lián)合培養(yǎng)，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經(jīng)成活率高。
（二） 取材。腦則取出相應組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側，分別培養(yǎng)。
（三） 細胞分離與接種。神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細口吸管吹打細胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細胞懸液，計數(shù)，預置細胞密度，接種于培養(yǎng)皿（1×106），做電生理應為5×105或更低。
（四） 抑制膠質(zhì)細胞生長。培養(yǎng)3-5d后，也有人認為培養(yǎng)7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的生長。
（五） 觀察。接種6-12h，開始貼壁，并有集合現(xiàn)象，細胞生長突起明顯，5-7d膠質(zhì)細胞增生明顯，7-10d膠質(zhì)細胞成片于神經(jīng)細胞下面，形成地毯，2周時神經(jīng)細胞生長最豐滿，四周暈光明顯，一個月后，有些神經(jīng)細胞開始退化，變形，甚至出現(xiàn)空泡，一般培養(yǎng)2-4周最宜。
但神經(jīng)細胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能傳代，不會有細胞周期，而且隨培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量在下降，但膠質(zhì)細胞可以，神經(jīng)膠質(zhì)細胞也可以。在培養(yǎng)過程中，早期9-12d時，有較多的神經(jīng)細胞死亡，這是第一次死亡階段，應注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細胞一般突起長而多，且相互形成突觸。
（六） 常用培養(yǎng)細胞實驗有：FCM的蛋白總量分析；膜片鉗與離子通道的分析；免疫組化分析；
但免疫組化分析應注意，由于抗體直接作用于活細胞，不易穿透活細胞，故對核內(nèi)抗原定位時，首先考慮膜對抗體的通透性問題。常用化學試劑以增加其通透性或采用冰凍方法解決。
在免疫組化中，或其它組織學染色中，常用不同的染色方法以區(qū)分不同細胞，如半乳糖腦苷脂對小樹突膠質(zhì)細胞標記明顯；GFAP對星形膠質(zhì)細胞具有特異性染色等。這對研究神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細胞功能具有極大的應用價值。神經(jīng)膠質(zhì)細胞以往多被忽視，其在腦血管疾?。ㄈ缛毖該p傷）、退行性疾病（如AD、PD）、損傷后膠質(zhì)細胞的填充等具有不可忽視的作用。它也是神經(jīng)細胞功能和營養(yǎng)支持的物質(zhì)基礎。
第四節(jié) 肌組織細胞培養(yǎng)
各種肌組織均可用于培養(yǎng)，以心肌和骨骼肌較實用。
（－）骨骼肌細胞培養(yǎng)
1、出生1一2天的乳鼠，引頸處死。
2、無菌取大腿肌組織，切成0.3一0.5cm2小塊后，用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化，無菌紗網(wǎng)或紗布濾過。
3、計數(shù)調(diào)整細胞密度。
4、快接種量2×106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng)。
5、培養(yǎng)基內(nèi)含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促進分化。
接種在膠原或膠原的底物上能促進細胞分化，明膠配置：用Hanks液配成0.01%明膠。
該細胞接種率約50%，細胞生長開始呈紡錘形，培養(yǎng)50－52小時后出現(xiàn)融合形成肌細胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止，此時可觀察到橫紋，一般在融合后二、三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象。
（二）心肌細胞培養(yǎng)
心肌細胞是最早的培養(yǎng)材料，Carrel曾長期培養(yǎng)過心肌組織，至今心肌仍不失為好的培養(yǎng)物，最常用的是雞胚心肌。
心肌比較容易培養(yǎng)和生長，可用懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法，均可獲良好的效果。取心室肌培養(yǎng)較好，原代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形，培養(yǎng)成功時，一周后可見節(jié)律性收縮現(xiàn)象。
第五節(jié) 巨噬細胞培養(yǎng)
巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長期生存。
巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養(yǎng)中呈巨噬細胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。
培養(yǎng)巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞，以小鼠腹腔取材法最為實用，其法如下：
1、實驗前三天，向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內(nèi)?。源塘鳟a(chǎn)生大量的巨噬細胞。
2、引頸處死小鼠。
3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。
4、置動物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側，暴露出腹膜壁。
5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時用手指從兩側壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內(nèi)流動。
6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。
7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。
8、4℃下250g離心10分鐘后，去上清，加10ml Eagle培養(yǎng)基。
9、計數(shù)細胞。每只鼠可產(chǎn)生20一30×106細胞，其中90%為巨噬細胞。
10、以3×105個貼附細胞/平方厘米接種。
11、接種數(shù)小時后，除去培養(yǎng)液，可去除其它白細胞，純化培養(yǎng)細胞，用Eagle液沖洗1一2次，再加新Eagle培養(yǎng)液置CO2溫箱中。
第六節(jié) 腎小球分離、移植培養(yǎng)
SD大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡1～2分鐘，2次，置超凈臺內(nèi)，打開腹腔取出腎臟剪碎，置含Hank's液的無菌培養(yǎng)皿洗滌，置80目不銹鋼篩網(wǎng)上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產(chǎn)物微小組織透過篩網(wǎng)，濾過組織Hank's液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網(wǎng)，濾過，去小組織塊，濾過物吸至200目不銹鋼篩網(wǎng)，輕輕濾過，Hank's液洗滌1次，收集網(wǎng)上腎小球，鏡下觀察為分離良好的腎小球。
腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶，37℃消化20分鐘，加血清終止胰酶反應，離心除去膠原酶。處理過的腎小球計數(shù)后接種至24孔培養(yǎng)板或25ml培養(yǎng)瓶，使腎小球大于60個/cm2，加培養(yǎng)基5～10ml（培養(yǎng)基組成：F12—3T3上清1：1；5%馬血清；2.5%胎牛血清；胰島素5μg/ml；25ng/ml氫化可的松；5μg/ml轉鐵蛋白；25ng/ml前列腺素E1；甲狀腺素0.02ng/ml；D-纈氨酸150ng/ml）腎小球培養(yǎng)8～10天，去除腎小球未生長組分，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時，形態(tài)學觀察：細胞生長成單層多角型細胞，直徑約100μm。
第七節(jié) 裸小鼠移植瘤單細胞分離培養(yǎng)
無菌條件下取出小鼠移植瘤組織，剪成1mm3小塊，用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時，再加等體積0.2%胰酶消化5～8分鐘，在消化過程中用吸管吹打組織塊或用自制裝置（分別作為加樣和收集器的兩個注射器中間加一小濾器連接而成，濾器中間墊兩層絲質(zhì)材料以隔斷組織塊與單細胞）來回推動注射器吹打組織以分離單細胞，終止酶消化方法同上。
常規(guī)方法接種培養(yǎng)收獲細胞。
