在進(jìn)行低濃度定量菌株菌懸液制作時，通常使用十倍或百倍稀釋法進(jìn)行制作。
十倍稀釋法的具體操作步驟
1.將生理鹽水（或磷酸鹽緩沖液等）分裝至試管中，每支裝量為9mL（百倍稀釋可用10mL，特殊情況也可使用9mL做近似百倍稀釋），進(jìn)行滅菌處理（121℃滅菌15-30min即可）；
注：在進(jìn)行厭氧菌（如生孢梭菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌）稀釋時，選用0.1%蛋白胨水或pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液做為稀釋劑效果更佳；若不在厭氧環(huán)境中操作，從開始稀釋至使用菌懸液結(jié)束要控制在15min以內(nèi)，時間過長會導(dǎo)致菌體死亡。
2.將滅菌后裝有9mL生理鹽水的試管編號1，2，3，4，5，6，7，8。
3.將一定量的菌加入至編號1的試管中制成第一稀釋梯度菌懸液（通常稱為10-1梯度），使用旋渦振蕩器混勻。
4.吸取1mL10-1梯度菌懸液至編號2的試管中，混合均勻，就得到了第二稀釋度的菌懸液（通常稱為10-2梯度，若吸取10-1梯度菌懸液100μL至10mL生理鹽水管中，即為百倍稀釋，可以直接得到10-3梯度菌懸液）。
5.以此類推，可以得到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度菌懸液，每一支管的含菌量都是前一直管的1/10，第8支管的菌液濃度就是第1支管的千萬分之一了，如果第一支試管含菌量是109CFU/mL，第8支管就可以得到100CFU/mL左右濃度的菌懸液了。
制備第一支試管的菌懸液及確定第一支試管中菌液的濃度，一般采用以下四種方法：
將一定量培養(yǎng)好的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到第一支試管中(可以用菌液，可以挑取菌落），制備成約5麥?zhǔn)蠞岫鹊木粶啙峋鷳乙海s109CFU/mL）。
優(yōu)點(diǎn)：新手可直接上手操作。
缺點(diǎn)：不同細(xì)菌體積大小有差別，有些芽孢菌容易聚成團(tuán)塊不易制得均一懸液；不適用于真菌孢子懸液制備。
注意事項(xiàng)：不同細(xì)菌的麥?zhǔn)蠞岫扰c濃度之間存在差異，第一次試驗(yàn)之前最好先進(jìn)行驗(yàn)證；麥?zhǔn)蠞岫葻o法區(qū)分細(xì)菌死活，因此最好使用新活化的菌制備；真菌（酵母菌）體積較大，同等濁度下濃度約為細(xì)菌的1/20。
細(xì)菌在600nm波長處具有最大吸光度，在一定濃度下，細(xì)菌的濃度與OD600nm呈正比關(guān)系，因此可以通過測量OD600nm值來確定菌懸液濃度。此方法更常用于測定菌液濃度（觀察細(xì)菌生長曲線），也可在制備105-107CFU/mL的菌懸液時使用，不適用于低濃度菌懸液制備。
將菌株接種至非選擇性肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，吸取1mL培養(yǎng)物至9mL生理鹽水中制成10-1梯度菌懸液（約108CFU/mL），稀釋至10-6或10-7即可得到10-100CFU/mL菌懸液。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡單
缺點(diǎn)：菌數(shù)不穩(wěn)定，受細(xì)菌種類、培養(yǎng)基影響較大；僅適合均勻渾濁生長的細(xì)菌或真菌；若培養(yǎng)過程發(fā)生污染，不易察覺。
注意事項(xiàng)：不同菌株生長時間不同，在不同培養(yǎng)基中生長濁度也不同，如大腸埃希氏菌、金黃色葡萄菌、沙門氏菌等在TSB中過夜培養(yǎng)即可，乳酸菌通常需在MRS肉湯中培養(yǎng)48-72h，酵母菌、白色念珠菌需在SDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-5天。酵母菌、芽孢菌通常在10-5稀釋度左右，就可以得到10-100CFU/mL的菌懸液。
從平板或斜面上挑取一定量的菌苔（2-3mm單個菌落，菌落偏小可多挑幾個菌落）至9mL生理鹽水中振蕩均勻，制成10-1梯度菌懸液（約108CFU/mL），稀釋至10-7或10-8即可得到10-100CFU/mL菌懸液。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，相比較于其他稀釋方法，最大優(yōu)勢就是更容易準(zhǔn)確控制菌數(shù)濃度；適用范圍廣，細(xì)菌、真菌均可采用此方法制備菌懸液。
缺點(diǎn)：需要嘗試和經(jīng)驗(yàn)
注意事項(xiàng)：不同菌株制成的菌懸液濃度同樣存在差異，初次進(jìn)行特定菌株稀釋時需要做驗(yàn)證；一般非芽孢細(xì)菌制成的10-1梯度菌懸液約為108-109CFU/mL，而芽孢菌和酵母菌制成的10-1梯度菌懸液約為106-107CFU/mL。
初次進(jìn)行菌液制備時，可以選用方法1和方法4，多做幾個稀釋度測試，熟練有經(jīng)驗(yàn)后使用方法4進(jìn)行菌液制備，可輕松準(zhǔn)確制得10-100CFU/mL或20-200CFU/mL濃度菌懸液。
制備好的菌懸液可在驗(yàn)證過的時間內(nèi)使用，使用時間一般與稀釋劑有關(guān)，接下來我們再來講一下稀釋劑的選擇和應(yīng)用：
1.0.85%生理鹽水或0.9%氯化鈉溶液
在國標(biāo)中通常使用0.85%生理鹽水，中國藥典中常使用0.9%氯化鈉溶液，二者效果無明顯差別，可適用于絕大多數(shù)細(xì)菌或真菌的菌懸液或孢子懸液制作（孢子懸液較穩(wěn)定一般可在2-8℃存放一個月或者更長時間）。
2.磷酸鹽緩沖液
與生理鹽水效果接近，可用于菌懸液制備和稀釋，但更常用于樣品的稀釋。
3.0.1%蛋白胨水或pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液
相比較于生理鹽水，此兩種緩沖液對于產(chǎn)氣莢膜梭菌、生孢梭菌等厭氧菌的效果更好，更能保持細(xì)菌的活性。該培養(yǎng)基因含有少量蛋白胨，細(xì)菌易發(fā)生繁殖導(dǎo)致菌數(shù)發(fā)生變化，通常制備的菌懸液需在短時間內(nèi)使用（一般細(xì)菌建議在45min內(nèi)使用，厭氧菌建議在15min內(nèi)使用）。
霉菌的孢子懸液制備
將霉菌接種至沙氏瓊脂（或馬鈴薯葡萄糖瓊脂）斜面（或平板）進(jìn)行培養(yǎng)至產(chǎn)豐富的孢子，加入稀釋劑進(jìn)行洗脫（也可用接種環(huán)直接挑取一環(huán)孢子至稀釋液中），再用十倍或百倍稀釋法制成適宜濃度菌懸液。
注意事項(xiàng)：
（1）培養(yǎng)過程中不可密封培養(yǎng)，保持良好的透氣性有利于霉菌的生長和產(chǎn)孢子；
（2）不同的培養(yǎng)基營養(yǎng)存在差別，霉菌生長后期，培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)逐漸耗盡后，霉菌傾向于開始產(chǎn)孢子，因此在培養(yǎng)過程中不同培養(yǎng)基產(chǎn)孢子時間存在差異；
（3）孢子容易在空氣中漂浮擴(kuò)散，因此若采用接種環(huán)挑取孢子時，應(yīng)做好防擴(kuò)散污染的措施。
芽孢懸液制備
將芽孢菌接種至硫酸錳營養(yǎng)瓊脂（或其他產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基）36±1℃培養(yǎng)5-7天（或其他合適溫度培養(yǎng)），刮取菌苔至稀釋液中制成懸液，將菌懸液置于65℃中水浴30min（或沸水浴10min）殺死菌體，再用十倍稀釋或百倍稀釋法制成適宜濃度的芽孢懸液。
注：制備好的菌懸液原則上應(yīng)現(xiàn)制現(xiàn)用，但孢子懸液、芽孢懸液相對比較穩(wěn)定，可以在2-8℃保存較長時間，可在經(jīng)過驗(yàn)證的期限內(nèi)使用。
