原理

 

平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細(xì)胞牛長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細(xì)胞。統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。

但是，由于待測樣品往往不易完全分散成單個細(xì)胞，所以，長成的一個單菌落也可能來自樣品中的 2~3 或更多個細(xì)胞。因此平板密落計數(shù)的結(jié)果往往偏低。

平板菌落計數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時間才能取得，而且測定結(jié)果易受多種因素的影響。但是，由于該計數(shù)方法的最大優(yōu)點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗（如活菌制劑），以及食品、飲料和水（包括水源水）等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測。

 

材料與儀器

 

器材：無菌吸管、無菌平皿、盛有 4.5 ml 無菌水的試管、試管架、恒溫培養(yǎng)箱、記號筆

試劑：大腸桿菌懸液、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 1 ml

 

步驟

（1） 編號

取無菌平皿 9 套，分別用記號筆標(biāo)明 10-4 、10-5 、10-6 各 3 套。另取 6 支盛有 4.5 ml 無菌水的試管，排列于試管架上，依次標(biāo)明 10-1 、10-2 、10-3 、10-4 、10-5 、10-6。

（2） 稀釋

用 1 ml 無菌吸管吸取 1 ml 已充分混勻的大腸桿菌菌懸液（待測樣品），精確地放 0.5 ml 至 10-1 的試管中，此即為 10 倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。將 10-1 試管置試管振蕩器上振蕩。使菌液充分混勻。

另取一支 1 ml 吸管插入 10-1 試管中來回吹吸菌懸液三次，進(jìn)一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸入管底，吹時離開液面，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內(nèi)液體外溢。

用此吸管吸取 10-1 菌液 1 ml，精確地放 0.5 ml 至 10-2 試管中，此即為 100 倍稀釋……其余依次類推。

（3） 取樣

用 3 支 1 ml 無菌吸管分別精確地吸取 10-4 、10-5 、10-6 的稀釋菌液各 1 ml，對號放入編好號的無菌培養(yǎng)皿中。

（4） 倒平皿

盡快將上述盛有不同稀釋度菌液的平皿倒入溶化后冷卻至 45 ℃ 左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基約 15 ml/平皿，置水平位置，迅速旋動混勻，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。待凝固后，倒置于 37 ℃ 溫室中培養(yǎng)。

（5） 計數(shù)

培養(yǎng) 48 小時后，取出培養(yǎng)皿，算出同一稀釋度三個平皿上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計算：

每毫升中菌落形成單位 = 同一稀釋度三次重復(fù)的菌落平均數(shù) × 稀釋倍數(shù) × 5 一般選擇每個平板上長有 30~300 個菌落的稀釋度計算每毫升的菌數(shù)最為合適。同一稀釋度的三個重復(fù)的菌數(shù)不能相差很懸殊。由 10-4 、10-5 、10-6 三個稀釋度計算出的每毫升菌液中總活菌數(shù)也不能相差懸殊，如相差較大，表示試驗不精確。

平板菌落計數(shù)法的操作除上述傾倒平板的方式以外，還可用涂布平板的方法進(jìn)行（見微生物的分離和純化實驗）。

二者操作基本相同，所不同的是涂布平板法是先將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基溶化后倒平板，待凝固后編號，并于 37 ℃ 溫室中烘烤 30 分鐘左右，或在超靜工作臺上適當(dāng)吹干，然后用無菌吸管吸取稀釋好的菌液對號接種于不同稀釋度編號的平板上，并盡快用無菌玻璃刮棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實驗臺上 20~30 分鐘，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后再倒置于 37 ℃ 的溫室中培養(yǎng) 24~48 h。

 

注意事項

（1） 放菌液時吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結(jié)果誤差較大。

（2） 不要用 1 ml 吸管每次只靠吸管尖部吸 0.2 ml 稀釋菌液放入平皿中，這樣容易加大同一稀釋度幾個重復(fù)平板間的操作誤差。

（3） 由于細(xì)菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應(yīng)盡快倒入融化并已冷卻至 45 ℃ 左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細(xì)菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計數(shù)。

（4） 平板菌落計數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的，一般以三個稀釋度中的第二稀釋度倒平板所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在 50 個左右為最好，否則要適當(dāng)增加或減少稀釋度加以調(diào)整。

（5） 涂布平鈑用的菌懸液量一般以 0.1 ml 較為適宜，如果過少，菌液不易涂布開；過多則在涂布完后或在培養(yǎng)時菌液仍會在平板表面流動，不易形成單菌落。

 

常見問題

為了清楚地闡述平板菌落計數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位（cfu）而不以絕對菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。