支原體（mycoplasma）：又稱霉形體，在分類學(xué)上是處于細(xì)菌和病毒之間的一種微生物，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的最簡單的原核生物。支原體細(xì)胞中唯一可見的細(xì)胞器是核糖體。支原體直徑一般在0.2-0.8 ?m之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。支原體缺乏細(xì)胞壁，有變形能力，能通過濾菌器、可在無生命培養(yǎng)基中生長繁殖，在自然界分布極為廣泛?？蓪θ?、動物、植物、昆蟲等治病，造成極大危害。    支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中常見的一種污染源。細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染可能來自培養(yǎng)基、血清或?qū)嶒?yàn)操作者，會影響細(xì)胞生長率、細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)、細(xì)胞代謝和細(xì)胞活力。支原體對細(xì)胞的影響，主要從兩方面考慮：一方面是對細(xì)胞的直接影響，細(xì)胞被支原體污染后，增殖緩慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁上脫落，部分細(xì)胞雖然表面變化不十分明顯，實(shí)際上潛伏著多方面的危險；另一方面，支原體可以通過消耗培養(yǎng)基中的精氨酸，抑制細(xì)胞DNA、RNA的合成，降低細(xì)胞的抵抗力。總的來說，支原體污染對細(xì)胞造成的影響是多方面的：包括代謝、免疫或生化特性、生長狀況、酶的作用途徑、細(xì)胞膜的組成、染色體結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)染效率、以及細(xì)胞存活等多方面的改變。 支原體能輕易地通過標(biāo)準(zhǔn)濾膜，同時也能拮抗絕大多數(shù)的抗生素。而且，支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁，多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)微變化也可由于傳代、換液而緩解，因此易被忽視。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，對支原體的防范、檢測和去除非常棘手，也非常重要。污染實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)細(xì)胞的支原體主要有八種，通常用于細(xì)胞培養(yǎng)的絕大多數(shù)抗生素都對其無效。例如青霉素主要作用于細(xì)菌細(xì)胞壁，但支原體沒有細(xì)胞壁因此就不受影響。無懈可擊的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)始終是預(yù)防支原體污染的最佳方式，另外及時找出受到支原體污染的培養(yǎng)物也很重要，這樣才能在污染擴(kuò)散前快速采取有效措施。以下就為您介紹幾種在細(xì)胞培養(yǎng)中檢測支原體的常用方法。

1，  分離培養(yǎng)法

分離培養(yǎng)法是支原體檢測的金標(biāo)方法，其檢測精確度最高。這種方法是從可疑的細(xì)胞培養(yǎng)體系中取樣，并接種到最適宜支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會在這種瓊脂平板上瘋狂生長，最終形成明顯可見的特征性菌落。分離培養(yǎng)法基本不會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此被譽(yù)為支原體檢測金標(biāo)準(zhǔn)。不過分離培養(yǎng)法也存在兩個弊端，一是檢測時間太長，支原體要長出明顯克隆至少需要4周時間。二是盡管可以檢測絕大多數(shù)支原體種類，分離培養(yǎng)法也有力所不及的時候，例如支原體M. hyorhinis尚不能在體外進(jìn)行培養(yǎng)，因而不能使用這個方法。如果你實(shí)在不想等這么久，或者希望在分離培養(yǎng)法的等待過程中先拿到初步結(jié)果，你可以試一試DNA、PCR或酶學(xué)檢測方法。不過需要注意的是，上述檢測方法都不能單獨(dú)檢出所有類型的支原體，而且靈敏度也沒有分離培養(yǎng)法高，所以最好結(jié)合使用兩種方法以獲得最可靠的檢測結(jié)果。

2，  熒光法DNA檢測熒光法DNA檢測一般需要幾天時間。將可疑樣品與指示細(xì)胞共同培養(yǎng)，DNA檢測所用的指示細(xì)胞通常是細(xì)胞質(zhì)區(qū)域較大的Vero細(xì)胞，如果原樣本中含有支原體，那么當(dāng)細(xì)胞DNA被熒光染料（如Hoechst染料）染色時，就可以在指示細(xì)胞核周圍以及細(xì)胞膜周圍、培養(yǎng)基中觀察到熒光斑點(diǎn)或熒光顆粒。分離培養(yǎng)法用來檢測支原體M. hyorhinis菌株并不可靠，而DNA法可以準(zhǔn)確的將其檢測出來。這個方法的缺點(diǎn)是死亡細(xì)胞釋放出來的DNA會造成很大干擾，使得判斷誤差發(fā)生率大約在30%左右，因此使用這個方法需要一定的經(jīng)驗(yàn)。

3，  PCR法

 PCR法可以檢測所有種類的菌株，包括M. hyorhinis菌株。PCR法檢測支原體只需幾個小時，是最靈敏的支原體檢測方法。該方法采用針對支原體DNA的引物用PCR檢測可疑樣本，其中PCR引物通常針對支原體的16S rRNA基因的保守區(qū)域。在凝膠電泳過程中，支原體DNA會顯示為特異性條帶，以此指示支原體的存在。PCR法可以檢測所有種類的支原體，快速，靈敏度最高，缺點(diǎn)是不能區(qū)分支原體的死活。而且因?yàn)镻CR法過于靈敏，在操作過程中容易產(chǎn)生假陽性，所用的器具、槍頭、管壁等也都可能因?yàn)閿y帶微量的支原體DNA而導(dǎo)致假陽性現(xiàn)象。

4，  酶學(xué)檢測和ELISA

    酶學(xué)檢測是將可疑樣本添加到特定底物中，在這一體系內(nèi)支原體的酶可以將ADP轉(zhuǎn)化為ATP，隨后能利用ATP發(fā)光的luciferase酶就可以指示支原體的存在。這個方法的檢測速度最快，大概半小時即可完成，死亡的支原體不會造成干擾。缺點(diǎn)是靈敏度比PCR法低，而且需要的檢測發(fā)光的儀器尚未普及。ELISA也能用于支原體檢測，以ELISA法為基礎(chǔ)的支原體檢測一般使用針對支原體16S rRNA基因的帶標(biāo)記探針或抗體，來檢測培養(yǎng)物中是否含有支原體。這個方法現(xiàn)在已較少使用。 支原體定期檢測支原體污染會使培養(yǎng)細(xì)胞慢慢枯萎，因此對培養(yǎng)細(xì)胞定期進(jìn)行支原體檢測非常重要。一般來說每1至3個月就應(yīng)該進(jìn)行一次例行支原體檢測。將定期支原體檢測常規(guī)化堅持下去，是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對支原體污染的關(guān)鍵。對新引進(jìn)的細(xì)胞系應(yīng)進(jìn)行檢測，防止引入外來的污染源。對于凍存的細(xì)胞，在凍存之前或者放入液氮之前進(jìn)行檢測，以免以將含支原體的細(xì)胞作為種源保存。如何預(yù)防支原體污染支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基的污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材帶來的污染和用來制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個方面來預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作；細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌；在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。最好的預(yù)防支原體污染的方法就是嚴(yán)格操作，避免污染。