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細胞凍存

1) 當細胞匯合度達到 85%以上時,可進行凍存。

2) 在生物安全柜內,打開培養瓶瓶口,收集瓶內的培養基;

3) 向培養瓶內加入3ml無菌的 1×PBS 后,水平放置培養瓶,使PBS能夠浸潤到培養瓶底面上所有的面積,吸棄 PBS;

4) 向瓶內加入消化液1ml,浸潤底面后放入 37℃ CO2 培養箱中孵育 1~2min;

5) 孵育完成后在倒置顯微鏡下觀察細胞是否變圓飄起,若全部消化下來則直接向培養瓶內加入

注:如還有部分細胞未消化下來,可采用分步消化:2ml 含10%FBS 的培養基(這里的培養基可以用DMEM就行或者其他的基礎培養基)中,將懸液吸入15ml 離心管;

① 準備一個無菌的 15ml 離心管,加入 2ml 含 10%FBS 的培養基;

② 將消化下來的細胞吸入①中的離心管內中和(避免吹打);

③ 向之前消化的培養瓶中加入 1ml 胰酶繼續消化 2min 左右,輕拍培養瓶,95%左右細胞脫落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培養基中和,中和后的細胞懸液移入①中的離心管內。

6) 1000rpm 離心 5min;

7) 離心完成后,棄上清,用 1mL 凍存液重懸細胞沉淀,然后轉入 1.8ml 凍存管中;

8) 將凍存管轉入填充滿異丙醇的程序降溫盒中,之后轉入-80℃冰箱中過夜降溫;

9) 第二天,取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管,盡快轉入液氮罐中保存。

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