電子顯微鏡的誕生和發(fā)展大大推動(dòng)了人們對(duì)微觀世界的研究。借助電鏡技術(shù)，人們可以認(rèn)識(shí)亞顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)。離體培養(yǎng)細(xì)胞具有活力好、層次薄和易于取材、固定效果好等優(yōu)點(diǎn)，非常適宜于電鏡觀察。隨著電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，當(dāng)今的電鏡技術(shù)已包括了透射電鏡超薄切片技術(shù)與觀察，掃描電鏡樣品制備技術(shù)與觀察，電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，電鏡X射線顯微分析技術(shù)和電鏡圖像立體定量分析技術(shù)等，既可觀察細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)，也可了解功能，并進(jìn)行定性與定量分析。
一、透射電鏡細(xì)胞樣品制備技術(shù)和觀察方法
(一)原理
透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)是利用陰極發(fā)射的電子，通過(guò)陽(yáng)極中央的微孔形成的電子束穿透樣品獲得樣品的電子信號(hào)，經(jīng)物鏡、中間鏡和投影鏡等多級(jí)電子放大至數(shù)百至數(shù)千萬(wàn)倍，最后成像在熒光屏上便可即時(shí)觀察，或是投射到照相底片感光片上作為永久記錄。由于標(biāo)本必須置于高真空中進(jìn)行電鏡觀察，所以電鏡觀察的生物標(biāo)本必須特殊制備，不能含水，離體的生物標(biāo)本要迅速加以固定，以防產(chǎn)生結(jié)構(gòu)改變。另外，電子的穿透力很弱，這就需要把樣品制成50nm～100nm厚的超薄切片(一個(gè)細(xì)胞切成100～200片)。為了使柔軟的生物組織能夠制成這樣薄的切片，并使切片耐受高真空和電子轟擊，所以在切片前要進(jìn)行包埋。超薄切片技術(shù)是透射電鏡觀察成功的關(guān)鍵。
超薄切片制作樣品過(guò)程大體分為取材、固定、漂洗、脫水、滲透包埋與聚合、切片、染色等。細(xì)胞超薄切片技術(shù)中如何把細(xì)胞完整無(wú)損地從培養(yǎng)瓶皿壁上包埋下來(lái)是最大的難題。新的定型產(chǎn)品無(wú)菌聚苯乙烯塑料薄膜的使用解決了這個(gè)難題，把薄膜放在培養(yǎng)瓶皿中，讓細(xì)胞直接長(zhǎng)在塑料薄膜上，不僅細(xì)胞生長(zhǎng)效果好，而且可與細(xì)胞一起包埋切片，省去了許多麻煩。
(二)超薄切片基本操作步驟
1、取材
(1)離心法 適用于懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞或單層生長(zhǎng)細(xì)胞，欲觀察細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞低速離心，令細(xì)胞沉于錐形離心管底部，吸除上清液，立即加戊二醛固定。
(2)原位法 將無(wú)菌的聚苯乙烯薄膜(已消毒包裝的成品)剪成適宜的小塊置入培養(yǎng)瓶中，然后接種細(xì)胞懸液，待細(xì)胞附于薄膜上并生長(zhǎng)后，取出進(jìn)行固定。
1、固定
將離心管中的細(xì)胞團(tuán)塊或取出的薄膜移入青霉素小瓶中，在4℃用PBS漂洗3次，每次10分鐘。再用1% 四氧化鋨在4℃固定15～30分鐘，接著用PBS漂洗3次。
2、脫水
用系列丙酮在室溫下脫水。
50% 丙酮溶液1次，10分鐘。
70% 丙酮溶液1次，10分鐘。
90% 丙酮溶液2次，每次10分鐘。
100% 丙酮溶液3次，每次10分鐘。
3、浸透
吸棄瓶中脫水劑，加3mL純丙酮-EPON812包埋劑(1:1體積比)，室溫下放置30分鐘后，棄去稀釋的包埋劑，加純包埋劑1mL，室溫放置2小時(shí)或過(guò)夜。
5、包埋
(1)細(xì)胞團(tuán)塊 吸取混合包埋劑滴2滴于2號(hào)膠囊模塊孔的底部，把細(xì)胞團(tuán)塊移入膠囊底部中心，注滿(mǎn)混合包埋劑，放60℃烤箱烘烤2小時(shí)，使之固化成硬塊。
(2)細(xì)胞薄膜 將預(yù)先干燥的EPON明膠囊注滿(mǎn)混合包埋劑，倒蓋在單層細(xì)胞上，在60℃固化24小時(shí)。
6、修塊 將包埋塊安裝在特制的夾具上，在顯微鏡下用單刃刀片修整去除表面的包埋劑，并做記號(hào)以便定位。
7、切片 先將包埋塊固定在超薄切片機(jī)上，切厚約1μm的半薄切片，用蘇木素-伊紅染色法染色。鏡下觀察細(xì)胞圖像，確定進(jìn)行超薄切片的部位，并作標(biāo)記。準(zhǔn)備φ3mm，150～200目的銅網(wǎng)，用清洗液清洗，并用無(wú)水乙醇脫水干燥。制備好支持膜，小心放在銅網(wǎng)上。在超薄切片機(jī)上安裝三角形玻璃刀，固定包埋塊，切取50～70nm厚度的超薄切片，用睫毛筆挑選切片并用鋼絲環(huán)套取切片，貼在銅網(wǎng)有支持膜的一側(cè)，保存在干燥器皿中待染色。
8、電子染色：用一干凈培養(yǎng)皿，內(nèi)放干凈的牙科石蠟片。在石蠟片上加1至數(shù)滴醋酸鈉染色液，用鑷子夾住載網(wǎng)邊緣，把貼有切片的一面朝下，使載網(wǎng)浮在液滴上，蓋上培養(yǎng)皿染色5～30分鐘，染色后盡快用雙蒸水清洗三次。用濾紙吸去載網(wǎng)多余的水分，置培養(yǎng)皿內(nèi)自然干燥。再將載網(wǎng)放在另一只備有蠟片的培養(yǎng)皿中以同樣方法進(jìn)行檸檬酸鉛的染色及清洗。片染后涼干待觀察。
二、掃描電鏡細(xì)胞樣品制備
(一)原理
超薄切片實(shí)際上是樣品的二維切片，不能表達(dá)細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)，而且在觀察由切片所拍攝的顯微照片時(shí)，容易造成錯(cuò)誤的印象。用掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope,SEM)能直接觀察標(biāo)本表面的三維空間結(jié)構(gòu)，真實(shí)地反映各種細(xì)胞表面和斷裂面的形貌特征。其照明源與透射電鏡基本相同，由電子槍發(fā)射的電子束經(jīng)聚光鏡會(huì)聚成極細(xì)的電子探針，電子探針受掃描發(fā)生器控制，在樣品表面逐點(diǎn)逐線地掃描，樣品被電子轟擊所產(chǎn)生的二次電子被收集、轉(zhuǎn)換、放大，在電視熒光屏上同步掃描成像。二次電子的發(fā)射量與樣品的表面形貌有關(guān)，從而在熒光屏上出現(xiàn)表面起伏的樣品的立體圖像。掃描電鏡細(xì)胞樣品的預(yù)處理包括取材、固定、脫水等。
(二)基本步驟
(1)取材 一般原則與超薄切片相似，但用于掃描電鏡觀察的樣品塊略大，通常為5×8mm左右。
(2)固定 鋪片培養(yǎng)的細(xì)胞取出浸入PBS中，漂洗細(xì)胞表面。然后將細(xì)胞鋪片放入青霉素小瓶中，加4℃預(yù)冷的3% 戊二醛，在4℃固定2小時(shí)或過(guò)夜，吸出固定劑，用PBS浸洗2次，每次10分鐘，再用4℃預(yù)冷的1% 鋨酸，在4℃固定1小時(shí)，然后用PBS浸洗2次，每次10分鐘。
(3)脫水 丙酮/醋酸異戊酯(1:1)10分鐘，接下來(lái)醋酸異戊酯30分鐘，或用系列梯度酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)脫水，每種濃度酒精通過(guò)2次，每次15分鐘。
(4)干燥 以臨界干燥法最理想，但必需要有專(zhuān)門(mén)的儀器，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室不具備此種儀器時(shí)，可采用冰凍干燥法和乙腈干燥法。乙腈干燥法的關(guān)鍵是乙腈置換。樣品經(jīng)上述處理后，浸入50%的乙腈水溶液中，然后依次更換70%、80%、90%、95%、100%的乙腈溶液，每次浸泡15～20分鐘，最后再換100%乙腈。然后進(jìn)行真空干燥。即將乙腈置換后的樣品連同青霉素瓶一起放到真空鍍膜臺(tái)的空中置內(nèi)，抽低真空，一般需30～50分鐘。樣品干燥后，待其溫度升至室溫時(shí)再放氣，取出樣品。
(5)樣品導(dǎo)電處理：用真空噴鍍法。所用儀器為真空噴鍍儀，樣品被安置在離蒸發(fā)源約10～15cm處的樣品臺(tái)上，樣品進(jìn)行旋轉(zhuǎn)活動(dòng)，先噴碳，后噴金，噴鍍應(yīng)均勻，完成后待鏡下觀察。
