1、以無菌操作方式開啟菌種管，加入適量營養肉湯培養基，吹吸數次，使菌種融化分散。取含5.0 mL～10.0 mL營養肉湯培養基試管，滴入少許菌種懸液，置36 ±1 培養18 h～24 h。用接種環取第1代培養的菌懸液，劃線接種于營養瓊脂培養基平板上，置36 ±1 培養18 h～24 h。挑取上述第2代培養物中典型菌落，接種于營養肉湯培養基，置36 ±1 培養18 h～24 h，即為第3代培養物。
2、用10.0 mL吸管吸取5.0 mL～10.0 mL第3代～5代的18 h～24 h營養肉湯培養物，接種于羅氏瓶（或細胞培養瓶）營養瓊脂培養基表面，將其搖動使菌液布滿培養基表面，將多余肉湯培養物吸出，羅氏瓶（或細胞培養瓶）置36 ±1 恒溫培養箱內培養5 d～7 d。
3、用接種環取少許菌苔涂于玻片上，以改良芽胞染色法染色。改良芽胞染色法：用接種環取菌苔涂于玻片上，自然干燥后，通過火焰加熱將菌固定于玻片上；將涂片放入平皿內，片上放兩層濾紙，滴加足量的5.0%孔雀綠水溶液，將平皿蓋好，置55 ±1 加熱30 min。取出，去濾紙，用自來水沖去殘留液；加0.5%沙黃水溶液，1 min后水洗，待干后鏡檢。芽胞呈綠色，菌體呈紅色。在顯微鏡（油鏡）下鏡檢，當芽胞形成率達90%以上時，即可進行以下處理。否則，繼續在室溫下放置一定時間，直至達到上述芽胞形成率后再進行以下處理。
4、加10.0 mL無菌蒸餾水于羅氏瓶（或細胞培養瓶）中，以L棒輕輕刮下菌苔，吸出，再加入5.0 mL無菌蒸餾水沖洗培養基表面，吸出。將兩次吸出的菌懸液集中于含玻璃珠的無菌錐形燒瓶中，振搖5 min。
5、將燒瓶置45 水浴24 h，使菌自溶斷鏈，分散成單個芽胞。
6、用無菌棉花或紗布過濾芽胞懸液，清除瓊脂凝塊。
7、將芽胞懸液置無菌離心管內，以3000 r/min速度離心30 min。棄上清液，加蒸餾水吹吸使芽胞重新懸浮。再離心和重新懸浮清洗，本步驟重復進行3遍。
8、將洗凈的芽胞懸液放入含適量小玻璃珠的燒瓶內，80 水浴10 min（或60 水浴30 min），以殺滅殘余的細菌繁殖體。待冷至室溫后，搖勻分裝后冷藏保存備用，有效使用期6個月。
10、懷疑有污染時，以菌落形態、革蘭染色與生化試驗等方法進行鑒定。
本文節選自中華人民共和國衛生行業標準《WS/T 683—2020消毒試驗用微生物要求》。
